恒興醫藥重磅推出——基于Caco-2模型的生物等效性豁免滲透性分類服務
來源：恒興醫藥
一、BCS簡介及其應用
BCS 分類系統由AMIDON等科學家于1995 年提出，將藥物按照其水溶性和腸道滲透性分為4 類，以進行化合物口服吸收的預測：
在過去的幾十年中，BCS分類系統得到了廣泛的研究和實際應用。2000年以后，美國食品藥品管理局(FDA)、歐洲藥品管理局( EMA)、世界衛生組織(WHO)、中國國家藥品監督管理局(NMPA)等都各自發布了基于BCS 分類的生物等效性豁免指導原則。這種基于BCS分類的生物等效性豁免思路，其基本邏輯是：藥物的口服吸收取決于其在胃腸道的溶解性/溶出度以及滲透性，如果相同的活性成份在胃腸道環境中具有相同的濃度－時間曲線、且吸收過程以及滲透性不受到輔料的影響，那么其吸收程度和吸收速度也應相同，則該藥物亦可無需通過臨床試驗以證明其體內生物等效性。因此，基于BCS分類的生物等效性豁免思路被認為是藥物開發中一種節省大量成本和時間的可行方法。
盡管都基于相同的原理和大致的路線，各國/地區監管機構在其各自指導原則中的具體技術指南并不完全相同。因此，為了促進國際申請并整合不同的生物豁免標準，ICH（國際人用藥品注冊技術協調會）于2016年10月年開始組織編寫關于生物等效性豁免申請的總括指南ICH M9，并于2019年11月發布了最終指導原則。目前，M9 指導原則已進入ICH 程序的第5 階段，即實施階段，在實施階段中將由各ICH各成員國/成員機構按照各自的行政程序和步驟予以實施。我國國家藥品監督管理局（NMPA）在2021年第61號公告（發布日期：4月28日）中明確了自該公告發布之日起6個月后開始的相關研究（以試驗記錄時間點為準），適用上述ICH指導原則。與M9最終版同時發布的問答文件對該指導原則中部分問題作了進一步說明，其中有大量筆墨是與Caco-2相關的論述和解釋。
二、Caco-2在基于BCS分類的生物等效性豁免方法中的作用
Caco-2細胞系于20 世紀70 年代首次分離自人類結直腸癌細胞, 其模型最初是由Borchardt 和WorkeM在1989 年提出的。以普通的培養條件培養成熟的Caco-2細胞即可形成與小腸上皮細胞相同的細胞極性和致密的單細胞層組織，其形態和功能上與人體的小腸上皮細胞相似。成熟的Caco-2細胞在貼壁單層的狀態下具有極化的頂端側（apical side，對應于腸腔絨毛側）和基底側（basolateral side，對應于血管側），可以作為藥物分子透過小腸上皮細胞吸收入血的良好體外評價工具。近三四十年來，Caco-2細胞作為藥物腸道吸收預測的模型已經得到極為廣泛的研究、關注和應用。也因此，Caco-2成為了基于BCS分類的生物等效性豁免實踐工作中對滲透性分級的重要工具。
當然，對于藥物滲透性分級來講，除了Caco-2模型外，研究界還有一些其他的工具包括離體腸囊外翻模型、在體腸灌流以及其他的單層細胞模型如MDCK等。我國NMPA于2016年05月18日發布的《人體生物等效性試驗豁免指導原則》中提到了以上這些可能的模型，FDA指導原則中提到了包括Caco-2在內的“單層細胞模型（in vitro permeation studies across a monolayer of cultured epithelial cells）”，而EMA指導原則中則提到了更廣泛而言的“良好的體外試驗（Well performed in vitro investigations）”。
但值得注意的是，ICH生物等效性豁免指導原則中對于非人體試驗系統的描述中，僅提到了Caco-2并進行了詳細的實驗體系設計和驗證的說明。對此，與M9最終版同時發布的問答文件做出了解釋，原文如下：
問：為何滲透性評價僅限于Caco-2細胞系？可否使用其他經充分驗證的細胞系來評估BCS分類的滲透性，例如MDCKII、LLC-PK1？
答：普遍認為可以通過其他體外（其他細胞系，例如MDCKII）或原位（Loc-I-Gut）/離體（大鼠外翻腸囊模型）工具評估滲透性，但是，因為除美國FDA外，任何其他監管機構均尚未建立體外滲透性評價方法，因此先使用現有經驗最多的方法。將來，當監管機構獲得更多體外數據經驗時，可考慮其他細胞系或動物離體和原位方法，但只限于根據當前指導原則草案附錄I中所述原則進行嚴格驗證和標準化的方法。
恒興醫藥完全參照ICH M9中的具體實驗要求及建議，建立了基于Caco-2單層細胞模型的生物等效性豁免滲透性分類評價體系，并對建立的評價體系經過了充分和完整的驗證，結果完全符合預期，可以達到清晰的“高滲透性-非高滲透性”二元分類目的并用于支持藥物的生物等效性豁免申報。
在恒興醫藥的驗證工作中，我們根據ICH M9指導原則中所列明的模型化合物中選擇了21種化合物，其中包括低（Fa < 50%）、中（50% < Fa < 85%）、高（Fa≥ 85%）滲透性模型化合物各至少5個、并包括一個零滲透化合物。對這些模型化合物，在兩個不同的生理相關的pH值條件下測得其表觀滲透系數（Papp），每一個模型化合物包含至少三次實驗數據（每次實驗數據包含三個平行的測試）。通過文獻報道的體內吸收分數，我們建立了這些化合物與它們的表觀滲透系數之間的良好相關性。通過作圖以及公式擬合，我們可以實現化合物在體內吸收程度的良好預測，并且實現清晰的高滲透性藥物的定性。需要注意的是：應用該預測系統的前提條件是，受試化合物不具有嚴重的轉運體介導的事實和傾向。
驗證結果如下圖所示：
圖1. 恒興醫藥使用21種模型化合物的Caco-2試驗表征結果。將頂端側pH 6.5和基底側pH 7.4或頂端側pH 7.4和基底側pH 7.4下獲取的Papp（A-B）與人口服吸收數據（Fa）作圖。畫圈標記的即為中/高滲透性分級指標性化合物。
在恒興醫藥的評價體系中，高滲透性化合物組別中的一個偏低的化合物A被確定為“中—高”滲透性定性分級指標性化合物，而低滲透性化合物組別中的一個偏高的化合物B則被確定為“低—中”滲透性定性分級指標性化合物（ICH M9指導原則中稱這些定性分級指標性化合物為“分級內標”）。在滲透性定性分級評價中，將受試化合物與前述指定的指標性化合物進行平行實驗，測得各自的表觀滲透系數，通過相對高低的比較來實現滲透性高低的定性。實驗的結果需落在指標性化合物可接受的數值范圍內，以確保定性分級的可靠性。
四、恒興醫藥Caco-2滲透性分級服務包
恒興醫藥基于Caco-2的BCS滲透性分級研究服務包中，體系驗證與受試物試驗將分開進行。其中包括21個模型化合物的體系驗證將保持一年有效期，而受試物試驗將在有效期內開展。
受試物的滲透性實驗將采用逐步試驗法。其中，在第一步即預實驗中，將在初步設定的一個或兩個濃度下進行單向或雙向（雙向為優）表觀滲透系數的測定，已初步證明受試化合物在Caco-2上的滲透性不依賴于初始藥物濃度或不依賴于轉運方向，由此初步確認化合物在受試濃度點上或受試濃度范圍內為被動轉運特性。在預實驗中，同時將檢測化合物在緩沖液中的溶解度、評估化合物在器材表面的吸附特性、評估化合物與單層細胞中成分的非特異性結合、單層細胞對化合物在測定濃度下的耐受性；預實驗所獲取的樣品也將用來評估樣品各種的濃度范圍并開發出具有合適定量范圍的生物分析方法。
在第一步預實驗完成后，我們可能會進行一些實驗條件的調整和優化（比如濃度的調整、解吸附劑的添加、分析方法的優化等），并開展第二步即確定性的實驗。在確定性的實驗中，我們將設定完整的三個濃度、并開展所有濃度下的雙向滲透性實驗。確定性的實驗完成后，我們將獲取完整的數據并根據監管標準準備完全的報告（包括體系驗證報告和受試物試驗報告）。所有的驗證和受試物試驗中，都將設置完整的質控對照組。所有實驗的完成將處于恒興專業的質量保證單元（QA Unit）及質量控制單元（QC Unit）監管和控制下。所涉及到的關鍵試驗元素如下表所示：
表1. 恒興醫藥用于BCS滲透性分級研究服務包元素的簡短描述
五、討論：基于Caco-2滲透性分級實驗的重要考慮因素
化合物除滲透性以外的一些不良特性，如有限的水溶性、與塑料表面和/或細胞成分的非特異性結合、細胞毒性作用等，如果不及早進行識別和考慮，可能會明顯影響到其測得的表觀滲透系數的可靠性，并因此影響到其最終滲透性定性結果的準確性。因此，恒興的成套服務中將包括一系列必需的支持性實驗內容，針對這些可能的不良特性進行考察和評估，用以輔助建立最優的滲透性測試條件。
1）溶解度、吸附性及回收率的考慮 受試化合物所設定的測試濃度如果超出其在緩沖液介質中的溶解度極限，將導致化合物析出而使化合物在Donor面的真實濃度小于理論濃度，最終將低估化合物真實的滲透性；同時，化合物在Donor面的析出將會直接影響到試驗后的物質回收率。受試化合物如果和塑料表面以及細胞成分具有較強的非特異性結合，將導致化合物在Donor和Receiver面的真實濃度均小于理論濃度，同樣會影響到物質回收率，但對滲透性測定的影響將更加無法預計。
在物質回收率較低的情況下，滲透性數據需要被小心地解讀和使用。M9指導原則提出：對于回收率<80%的情況，應進行物質平衡評價，包括測定細胞單層和試驗裝置上的藥物殘留量。在物質回收率相當低的情況下，通常會認為滲透性數據的可靠性存在較大的問題。這種情況下，可能需要采取一些必要的措施以提高回收率，比如增溶劑和解吸附劑的使用。但我們需要知道，這些措施可能會導致化合物的測得滲透性高于其真實滲透性，最終的結果仍然需要被小心地解讀和使用。
2）細胞毒性的考慮 如果受試化合物對試驗系統中的Caco-2細胞有毒性作用，則單層細胞的致密性可能受損，并且會檢測到所有標記物的整體更高的滲透性。而單層細胞致密性受損的情況下，滲透性數據顯然不能用于分類。為了實現更可信的滲透性分級，我們可能不得不將化合物濃度調整到合適的更低的濃度來獲取更可靠的滲透性數據。
3）生理pH值的考慮
許多藥物在Caco-2 單層細胞模型中的滲透性易受pH 值的影響。為了盡量減少假陰性結果的出現（即將非低滲透性藥物歸類為低滲透性藥物），我們將設置兩個不同的頂端側pH值（即pH 6.5及7.4），以更好地模擬腸道中的動態pH 值環境。在這兩個設定的pH 值條件下測得的滲透性，將有助于更完整可靠地評估受試化合物的滲透性及其分級。我們的測試體系驗證中，也已經分別對所有模型化合物測定了這兩個pH值條件下的滲透性，結果顯示均能實現良好的吸收預測和滲透性分級。
4）轉運體功能的考慮
有關體外滲透系統中轉運蛋白活性和功能的信息至關重要，并且一直在對生物等效性豁免提交的監管反饋中得到重視和強調。因此，作為我們BCS滲透性分級研究的一部分，應用了一套對照來確認外排轉運蛋白在Caco-2測試系統中的功能：在存在和不存在對照抑制劑的情況下，P-gp和BCRP特異性底物的外排比率具有明顯的變化即能證明測試系統中外排轉運蛋白的充分表達和活性。對受試化合物來講，需要證實其在轉運過程中不存在主動轉運機制。通常通過以下兩種方式之一或結合起來進行判斷：1）在不同的測試濃度下，從頂端側到基底側的表觀滲透系數不發生明顯變化（即濃度非依賴性的滲透性表現）；2）外排比率小于2。在恒興的測試方案中，我們推薦在所有的3個測試濃度下均進行雙向表觀滲透系數的測定后，綜合運用以上兩個標準進行評判以獲得更充分的證據。
5）實驗質量的保證
目前全球各國/地區的監管實踐下，對于除安全性評價以外的所有申報性非臨床研究，并未要求遵循GLP規范。對于此類原則上為Non-GLP的申報性研究，恒興醫藥都默認以GLP-Like的標準來要求。所有實驗都在恒興專業的質量保證單元（QA Unit）及質量控制單元（QC Unit）監管和控制下完成。我們在人、機、料、法、環、測等各方面都嚴格控制，保證數據生成的真實性、完整性和可溯源性，以確保實驗在質量和技術要求上都滿足中外所有監管要求。
恒興醫藥基于Caco-2模型的生物等效性豁免滲透性分類研究的方法驗證和受試物測試的最終驗證報告包含以下完整的信息：研究編號/標題、研究場所、研究日期、原始資料存儲信息、模型化合物/受試物/定量內標/指標性化合物的名稱/來源/含量純度信息、生物分析方法細節、藥物（指標性化合物及受試物）雙向滲透Papp值/回收率/外排比等信息。此外，還應包括建模所使用的模型化合物及人體吸收程度數據、數學模型等，這些完整的信息有利于申請人進行規范化的研究數據呈現與申報，支持相關監管部門的審批。
作者 | 恒興醫藥科學家團隊
